Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 98, Ottobre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Studio di prevalenza e valutazione del rischio Campylobacteriosi in allevamenti avicoli da carne e al mattatoio, nella Regione Marche
Campylobacterioris prevalence study and risk assessment in the poultry production and slaughter chain, in the Marche Region (Italy)


Valentina Silenzi, Alessandra Morelli, Francesca Ciuti, Marta Paniccià, Anna Duranti Annalisa Petruzzelli.



Abstract. Campylobacter has been identified as one of the most frequent causes of bacterial foodborne enteric disease, with more than 200,000 confirmed human cases/year (EFSA-ECDC 2015) and 48 cases per 100,000 population in European Union countries. Poultry has been recognised as elective reservoir for the transmission of Campylobacter to humans and, because of the significant impact that Campylobacteriosis has on public health and socio-economic system, the EU has adopted an integrated approach to food safety, involving the entire chain, from 'farm to fork'. The aim of this study, carried out during 2015 and 2016 by the IZSUM Diagnostic Laboratory in Fermo, was to provide a record of the poultry sector, whose data were not available yet, of the Marche Region and do the risk assessment of Campylobacter, to be able to guide prevention strategies at regional level providing useful information for the drafting of biosecurity plans. Cloacal swabs from several poultry farms, leading to one of the most representative firms in the Marche Region, and then chicken necks at slaughterhouse, were analysed to evaluate the presence of Campylobacter spp. These samples were tested for bacterial isolation and isolates were identified by phenotypic and biomolecular techniques. Sampling at slaughterhouse and, therefore, the related evaluation of the pathogen prevalence are still ongoing. Our next objective is to observe whether there is a correlation between Campylobacter strains isolated (and stored at 80°C) in the farms and those from slaughterhouse. In order to build this phylogenetic tree, we will apply, collaborating with the Regional Reference Laboratory for Enteropathogens (IZSUM Tolentino) and the National Reference Laboratory for Campylobacter (IZSAM Teramo), techniques such as Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and maybe more advanced and accurate methods such as Multilocus sequencing typing (MLST) and Next-Generation Sequencing (NGS)

Riassunto. Il Campylobacter è stata identificato come una delle più frequenti cause di malattie batteriche gastrointestinali di origine alimentare, con più di 200.000 casi notificati ogni anno nell'uomo (EFSA-ECDC 2015) e 48 casi ogni 100.000 abitanti nei paesi dell'Unione Europea. Il pollame è stato riconosciuto come reservoir elettivo per la trasmissione del Campylobacter all'uomo e il considerevole impatto che la Campylobacteriosi ha sulla salute pubblica e sul sistema socio-economico ha spinto l'UE a adottare un approccio integrato alla sicurezza alimentare che interessa l'intera filiera, dall'azienda agricola alla tavola. Scopo di questo studio, svolto dal Laboratorio di Diagnostica dell'IZSUM Sezione di Fermo negli anni 2015 e 2016, è fotografare la realtà avicola, di cui non erano disponibili dati a riguardo, della Regione Marche e fare la valutazione del rischio del Campylobacter per poter indirizzare le strategie di prevenzione a livello regionale e fornire indicazioni utili per la redazione dei piani di biosicurezza Per la valutazione della prevalenza del Campylobacter spp. sono stati presi in esame tamponi cloacali di polli da carne da allevamenti avicoli afferenti a una delle aziende più rappresentative del territorio marchigiano e successivamente i colli dei polli al macello. Tali campioni sono stati sottoposti a prove di isolamento batterico e gli isolati identificati con tecniche fenotipiche e biomolecolari. I prelievi al mattatoio e quindi la relativa valutazione della prevalenza del patogeno sono ancora in corso e l'obiettivo prossimo è osservare l'eventuale correlazione esistente tra i ceppi di Campylobacter isolati (e stoccati a -80°C) in allevamento e quelli al mattatoio. Per la costruzione di tale albero filogenetico ci avvarremo, grazie alla collaborazione con il Centro di Riferimento Regionale per gli Enteropatogeni (IZSUM Tolentino) e il Laboratorio Nazionale di Riferimento del Campylobacter (IZSAM Teramo), di tecniche quali la Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) e forse di metodiche più avanzate e accurate quali Multilocus sequencing typing (MLST) e Next-Generation Sequencing (NGS)



Negli anni 2015 e 2016 la sezione di Fermo, in particolare il laboratorio di Diagnostica, ha concentrato la propria attività di Ricerca sul ruolo del laboratorio come elemento strategico di sorveglianza delle zoonosi focalizzando l'attenzione sulla valutazione e gestione del rischio della Campylobacteriosi. Tale attività, della quale è stata incaricata la Dott.ssa Valentina Silenzi, si è sviluppata aderendo nel 2015 al "Programma di Attività 2015 finalizzato alla realizzazione dell'Obiettivo Regione Marche One Health: potenziamento dei sistemi di sorveglianza delle malattie infettive emergenti (di interesse umano veterinario) a trasmissione vettoriale -Valutazione e gestione del rischio della Campylobacteriosi" (codice PAM32015-Responsabile Scientifico Dott.ssa Marta Paniccià) e poi nel 2016 al "Programma di Attività 2016 finalizzato alla realizzazione dell'Obiettivo Regione Marche: Sorveglianza delle zoonosi: ruolo del laboratorio come elemento strategico della sorveglianza" (codice PAM22016-Responsabile Scientifico Dott.ssa Annalisa Petruzzelli - Dott.ssa Marta Paniccià).

Le zoonosi sono malattie causate da agenti in grado di infettare uomo e animali, sia direttamente che indirettamente tramite alimenti, ambiente ed insetti vettori. Queste malattie hanno un impatto significativo per l'elevato numero di casi, per la gravità che possono assumere, ma anche per le perdite economiche di cui sono responsabili nei settori produttivi, nell'industria alimentare e nel settore zootecnico. Sono più di 200 le malattie classificabili come "zoonosi" e circa il 75% delle malattie emergenti e riemergenti in Europa negli ultimi 10 anni è stato trasmesso da animali o da prodotti di origine animale.

Ogni anno, in Europa vengono confermati più di 320 000 casi nell'uomo, sebbene il numero effettivo sia probabilmente di gran lunga più elevato a causa di sottonotifiche e dalla mancata diagnosi eziologica dovuta ad uno scarso ricorso ad accertamenti di laboratorio.
La Commissione Europea (Direttiva 2003/99/CE) ha ufficialmente impegnato gli Stati Membri ad introdurre sistemi di sorveglianza più efficaci e coordinati sottolineando l'importanza di raccogliere dati attendibili sull'incidenza delle zoonosi di origine alimentare e non. Nell'ultimo report (EFSA 2015), relativo ai dati del 2013, la campylobacteriosi risulta essere la zoonosi maggiormente diffusa rispettivamente con 214779 casi umani confermati e 56 casi fatali, con costi elevati per il sistema sanitario e con perdita di produttività di circa 2,4 miliardi di euro all'anno. In Italia i casi di campylobacteriosi confermati nell'uomo sono solamente 0,76/100.000 abitanti, questo dato testimonia probabilmente un problema di sottonotifica dei casi e difficoltà nell'isolamento del patogeno. È noto che nella maggior parte delle regioni gli accertamenti diagnostici generici in caso di gastroenterite, prevedono solamente la ricerca della Salmonella, impedendo così di accertare la presenza di altri patogeni.
Episodi epidemici e sporadici di infezione da Campylobacter spp. sono stati associati prevalentemente al consumo di acqua o latte contaminati e a carne di pollo. Carni di maiale e di ruminanti sono generalmente considerate a basso rischio; tuttavia le frattaglie crude di questi animali sono a rischio piuttosto elevato di trasmissione e particolarmente importante è il loro ruolo nella contaminazione secondaria dei cibi pronti al consumo, nelle cucine domestiche. Per quanto riguarda i molluschi e i vegetali, se consumati crudi o poco cotti possono rappresentare un'ulteriore fonte di Campylobacter per il consumatore. Il pollame rappresenta una delle principali fonti di infezione per l'uomo. In Europa la quota di allevamenti avicoli risultati positivi alle indagini microbiologiche effettuate è variabile da Paese a Paese e va da un minimo del 5% a un massimo del 90%.

Per proteggere i consumatori da questa minaccia alla salute pubblica l'UE ha adottato un approccio integrato alla sicurezza alimentare che interessa l'intera filiera, dall'azienda agricola alla tavola. L'approccio consiste in misure di valutazione e di gestione del rischio, con la partecipazione di tutte le principali parti interessate: Stati membri dell'UE, Commissione europea, Parlamento europeo, EFSA e Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC). L'approccio è sostenuto da attività tempestive ed efficaci di comunicazione del rischio.
Poiché per la Regione Marche non ci sono dati disponibili sulla diffusione del Campylobacter nella filiera avicola, è stato e sarà molto utile volgere lo sguardo analitico e l'attenzione dovuta a una delle aziende avicole più rappresentative del territorio regionale, al fine di ottenere un quadro realistico della prevalenza del patogeno in allevamento, dell'eventuale diffusione al mattatoio e sulla tavola, nonché dei punti critici di contaminazione.

Gli obiettivi specifici dell'attività svolta e in essere sono:
Siamo partiti dall'individuazione della popolazione di riferimento rappresentata da aziende con un contratto di soccida con o di proprietà dell'azienda pilota regionale. L'unità di studio è la singola azienda sede di allevamento. Il campionamento ha previsto la raccolta di tamponi cloacali dai polli da carne di 50 giorni circa, suddivisi in pool e saggiati in isolamento per la rilevazione del Campylobacter (ISO10272-1:2006) presso il laboratorio di diagnostica IZSUM-Fermo. (Fig.1)

Figura 1. Campylobacter spp. Su Agar Sangue e Karmali
Figura 1. Campylobacter spp. Su Agar Sangue e Karmali


Gli isolati sono stati sottoposti a prove biochimiche e alla colorazione di GRAM e tipizzati mediante PCR MULTIPLEX (identifica i ceppi C.coli, C.jejuni, C.lari, C.upsalientis, C.fetus) per essere infine stoccati in ceppoteca a -80°C, in vista delle successive prove di correlazione filogenetica con i ceppi eventualmente isolati al mattatoio. (Fig.2 e Fig.3)

Figura 2. Mix e profilo termico della PCR Multiplex per Campylobacter, Wang et al. 2002
Figura 2. Mix e profilo termico della PCR Multiplex per Campylobacter, Wang et al. 2002




Figura 3. Corsa elettroforetica su gel d'agarosio al 1,5%
Figura 3. Corsa elettroforetica su gel d'agarosio al 1,5%


Ai fini del progetto è stata definita come azienda avicola positiva l'azienda sottoposta a prelievo e per la quale è risultato positivo almeno un pool all'isolamento. Per le aziende selezionate per il campionamento è stata prevista la raccolta dei dati relativi ai fattori di rischio che sono stati correlati con la presenza del Campylobacter spp.; per alcuni di questi fattori sono state individuate le caratteristiche dagli archivi dell'Anagrafe Avicola Nazionale, per altri, si è proceduto alla raccolta dati presso le aziende stesse. (Fig.4)

Figura 4.  Check list
Figura 4. Check list


Nella seconda fase dell'attività di ricerca in oggetto abbiamo raccolto i colli dei polli provenienti dalle stesse azienze afferenti all'azienda pilota e abbiamo valutato la presenza del Campylobacter mediante isolamento batterico e conferma dei ceppi per mezzo di prove biochimiche, GRAM e PCR MULTIPLEX. Gli isolati sono stati stoccati a -80°C.
Per la costruzione di tale albero filogenetico ci avvarremo, grazie alla collaborazione con il Centro di Riferimento Regionale per gli Enteropatogeni (IZSUM Tolentino) e il Laboratorio Nazionale di Riferimento del Campylobacter (IZSAM Teramo), di tecniche quali la Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) e forse di metodiche più avanzate e accurate quali Multilocus sequencing typing (MLST) e Next-Generation Sequencing (NGS).

Il nostro intento è di proseguire l'attività di valutazione della prevalenza del Campylobacter al mattatoio, in quanto tale fase è agli albori, ma soprattutto miriamo a realizzare dei protocolli diagnostici armonizzati che siano la base per il laboratorio e di supporto per le aziende dando così vita a linee operative da applicare all'intera filiera avicola.

L'ultima fase del progetto sarà la più interessante dal punto di vista epidemiologico e di valutazione del rischio, in quanto andrà a definire l'eventuale correlazione tra i ceppi isolati in azienda e quelli al mattatoio, con la costruzione di un albero filogenetico ottenuto tarmite PFGE e, magari, tecniche più avanzate quali MLST e NGS, avvalendoci della gentile collaborazione del Laboratorio Nazionale di Riferimento del Campylobacter (IZSAM-Teramo) presso il quale, entro il 2016, il personale dell'IZSUM-Fermo addetto al progetto verrà formato circa l'utilizzo delle metodiche appena citate.

Biblioteca

EFSA (European Food Safety Authority) and ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control), 2015. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2014. EFSA Journal 13(12), 4329.

Gehua Wang, Clifford G. Clark, Tracy M. Taylor, Chad Pucknell, Connie Barton, Lawrence Price, David L. Woodward, and Frank G. Rodgers. Colony Multiplex PCR Assay for Identification and Differentiation of Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, and C. fetus subsp. Fetus Journal of Clinical Microbiology, Dec. 2002, p. 4744-4747.

http://www.pulsenetinternational.org/assets/PulseNet/uploads/pfge/PNL03_CampyPFGEprotocol.pdf

ISO (International Organization for Standardisation), 2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 1: Detection method. ISO 10272-1:2006. Geneva, Switzerland: ISO.

Standard operating procedure for pulsenet PFGE of Campylobacter jejuni http://www.pulsenetinternational.org/assets/PulseNet/uploads/pfge/PNL03_CampyPFGEprotocol.pdf .


OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 98/2016 di SPVet.it



V. Silenzi et al. Studio di prevalenza e valutazione del rischio Campylobacteriosi in allevamenti avicoli da carne e al mattatoio, nella Regione Marche. (SPVet.it 98/2016)
V. Silenzi et al. Studio di prevalenza e valutazione del rischio Campylobacteriosi in allevamenti avicoli da carne e al mattatoio, nella Regione Marche. (SPVet.it 98/2016)



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Studio di prevalenza e valutazione del rischio Campylobacteriosi in allevamenti avicoli da carne e al mattatoio, nella Regione Marche by Silenzi V., et al., 2016 is licensed under a Creative Commons Attribuzione 2.5 Italia License.
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